Transfer gen melalui Retro-virus termediasiTransfer gen asing pada genom hewan juga dapat dilakukan dengan menggunakan retrovirus. Meskipun embrio dapat diinfeksi retrovirus sampai pertengahan kebuntingan, sel telur awal biasanya pada tahap 4-16 sel digunakan untuk infeksi dengan satu atau lebih rekombinan retrovirus mengandung gen asing.
Segera setelah infeksi, retrovirus memproduksi copy DNA dari genom mRNA menggunakan enzim virus yaitu reverse transcriptase. Kelengkapan proses ini membutuhkan sel host pada fase S dari siklus sel. Kemudian, retrovirus akan efektif mentransduksi hanya sel mitosis aktif. Infeksi yang tidak sempurna, yaitu tidak semua sel embrio mendapatkan retrovirus, terjadi lebih frekuen saat menggunakan embrio setelah tahap 4 sel, menghasilkan embrio chimera. Modifikasi retrovirus termasuk perpindahan struktur gen, seperti gag, pol, eny, mendukung formasi partikel virus. Terlebih lagi, kebanyakan retrovirus dan keturunan sejenis merupakan ecotropic yaitu hanya menginfeksi rodensia seperti tikus dan mencit dibandingkan manusia.
Copy DNA genom virus atau provirus berintegrasi secara acak pada sel genom host biasanya tanpa penghapusan maupun pengaturan ulang. Namun, seperti kasus transfer gen melalui mikroinjeksi, karena integrasi tidak melalui rekombinan homolog maka metode ini tidak efektif untuk mutagenesis site-directed.
Penggunaan retrovirus dalam transfer gen memiliki tingkat yang sangat tinggi, namun dengan kekurangan:
a) Rendahnya jumlah integrasi.
b) Membutuhkan tahap tambahan untuk memproduksi retrovirus.
c) Batasan ukuran DNA asing yang ditransfer (9-15 kb).
d) Potensial menghasilkan rekombinasi genetik yang tidak diharapkan yang mungkin mengubah retrovirus.
e) Frekuensi mosaic tinggi.
f) Kemungkinan interferensi melalui integrasi sekuen retrovirus pada ekspresi gen.
Teknologi sel stem embrionik
Transfer gen telah digunakan untuk memproduksi insersi maupun ablasi secara acak maupun tertarget dari fragmen DNA pada genom tikus. Untuk insersi tertarget, integrasi gen asing berdasar pada gen insersi rekombinan dengan homolog spesifik pada sekuen sel (disebut rekombinasi homolog), efisiensi DNA mikroinjeksi sangat rendah (Capechi, 1989). Sebaliknya, penggunaan transfer sel ES pada embrio tikus cukup efektif dalam memungkinkan investigator untuk memilih modifikasi genetik spesifik, melalui rekombinasi homolog, pada posisi kromosom yang tepat. Pemilihan ini memungkinkan produksi mencit yang:
a) Bergabung dengan gen asing pada genom mereka.
b) Membawa gen endogen termodifikasi.
c) Memiliki gen endogen spesifik yang rendah sehingga memungkinkan penghapusan gen atau prosedur “knock-out”.
Teknologi yang melibatkan sel ES dan sel germ primordial, telah digunakan untuk memproduksi host model tikus. Pluripotensial sel ES didapat dari embrio pre-implantasi awal dan dipertahankan pada kultur selama periode tertentu untuk menunjukkan beberapa manipulasi in vitro. Sel mungkin diinjeksi langsung pada blastocoel blastosit host atau diinkubasi bergabung dengan morula. Embrio host kemudian ditransfer pada host intermediate atau betina pengganti untuk kelanjutan perkembangan. Efisiensi produksi tikus chimera menghasilkan 30% keturunan hidup yang mengandung jaringan terderivasi dari sel stem terinjeksi. Kemampuan memproduksi hewan chimeric menggunakan sel ES telah memberikan peneliti alat lain dalam memproduksi hewan transgenik. Pada teknik ini, kekuatan teknologi transfer gen telah mengalami kemajuan karena beberapa proses memungkinkan insersi tertarget pada genom. Penargetan ini sangat penting, terutama pada area terapi dan koreksi gen, sedangkan teknologi terdahulu hanya memungkinkan integrasi acak.
Genom sel ES dapat dimanipulasi in vitro melalui pengenalan gen asing atau sekuen DNA asing melalui teknik elektroporasi, mikroinjeksi, reaksi presipitasi, transfeksi, atau insersi retrovirus. Penggunaan sel ES dalam memproduksi tikus transgenik menghadapi beberapa rintangan sebelum menjadi kompetitif dengan DNA mikroinjeksi sebagai teknik standar model tikus. Dalam beberapa tahun, penambahan teknik coculture melibatkan embrio host tetraploid (tahap 8 sel sampai morula) telah menghasilkan hewan awal yang terderivasi lengkap dari sel ES ter-coculture (Wood dkk., 1993). Oleh karena itu, hewan awal tidak lagi merupakan hewan chimera, karena semua sel datang dari sel progenitor yang sama dan hewan awal akan dapat berkembang biak dengan baik (dan diyakini menghubungkan modifikasi genetik pada keturunan pertama).
Namun, saat keturunan sel ES telah diidentifikasi untuk spesies selain tikus, produksi komponen germ-line ES terderivasi/chimeric dari hewan ternak belum dilaporkan. Dengan adanya teknologi terkait transfer nukleus, kebutuhan mengidentifikasi dan menggunakan sel ES atau sel germinal primordial (PGCs) akan mempengaruhi perubahan genetik dan mungkin semakin tidak konsekuen.
Teknologi lain: dari spermatozoa hingga kloning
Berbeda dengan perkembangan manipulasi embrio, kebijaksanaan yang sangat berbeda telah diambil dengan adanya prosedur transfer sperma. Pada 1989, transfer gen termediasi sperma telah dilaporkan namun dibantah saat banyak laboratorium di seluruh dunia tidak dapat melakukan lagi prosedur tersebut. Kemudian pada 1994, berita sperma termediasi menimbulkan ketertarikan dan menghasilkan perkembangan prosedur transplantasi sel spermatogonia sebagai alternatif potensial bagi transfer gen in vivo (Brinster dan Avarbock, 1994). Namun, semua hewan dan teknik sel somatik (termasuk transfer gen liposome termediasi, pengeboman partikel, dan injeksi jet), bersama dengan sistem vektor novel, akan berlanjut untuk berkembang dengan tujuan untuk merekayasa genetik hewan pada cara yang efisien dan efektif.
Pada awal 1980-an, beberapa laboratorium melaporkan percobaan transfer nukleus pada hewan laboratorium. Beberapa studi ini kontroversial, kebanyakan fokus pada hewan domestik dan vertabrata non-mamalia. Seperti yang akan dijelaskan pada bab selanjutnya, transfer nukleus telah dilakukan dengan fokus percobaan rekayasa genetika.
Produksi Hewan Domestik Transgenik
Kesuksesan percobaan tikus transgenik mengawali sejumlah kelompok penelitian untuk mempelajari transfer gen tersusun yang mirip pada germ-line spesies hewan domestik. Dengan perkecualian, usaha ini mengarah pada dua tujuan utama: meningkatkan produktifitas spesies hewan domestik sebagai bahan pangan atau perkembangan hewan transgenik untuk bioreaktor (produksi kebutuhan medis atau protein penting biologi). Sejak 1985, mayoritas hewan ternak transgenik diciptakan menggunakan gen pertumbuhan tersusun. Namun sayangnya, pada kebanyakan bagian, fenotip pertumbuhan ideal tidak dapat dicapai karena ketidakmampuan untuk mengkoordinasi pengaturan ekspresi gen dan berakibat pada gangguan endokrin.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 3
Copy DNA genom virus atau provirus berintegrasi secara acak pada sel genom host biasanya tanpa penghapusan maupun pengaturan ulang. Namun, seperti kasus transfer gen melalui mikroinjeksi, karena integrasi tidak melalui rekombinan homolog maka metode ini tidak efektif untuk mutagenesis site-directed.
Penggunaan retrovirus dalam transfer gen memiliki tingkat yang sangat tinggi, namun dengan kekurangan:
a) Rendahnya jumlah integrasi.
b) Membutuhkan tahap tambahan untuk memproduksi retrovirus.
c) Batasan ukuran DNA asing yang ditransfer (9-15 kb).
d) Potensial menghasilkan rekombinasi genetik yang tidak diharapkan yang mungkin mengubah retrovirus.
e) Frekuensi mosaic tinggi.
f) Kemungkinan interferensi melalui integrasi sekuen retrovirus pada ekspresi gen.
Teknologi sel stem embrionik
Transfer gen telah digunakan untuk memproduksi insersi maupun ablasi secara acak maupun tertarget dari fragmen DNA pada genom tikus. Untuk insersi tertarget, integrasi gen asing berdasar pada gen insersi rekombinan dengan homolog spesifik pada sekuen sel (disebut rekombinasi homolog), efisiensi DNA mikroinjeksi sangat rendah (Capechi, 1989). Sebaliknya, penggunaan transfer sel ES pada embrio tikus cukup efektif dalam memungkinkan investigator untuk memilih modifikasi genetik spesifik, melalui rekombinasi homolog, pada posisi kromosom yang tepat. Pemilihan ini memungkinkan produksi mencit yang:
a) Bergabung dengan gen asing pada genom mereka.
b) Membawa gen endogen termodifikasi.
c) Memiliki gen endogen spesifik yang rendah sehingga memungkinkan penghapusan gen atau prosedur “knock-out”.
Teknologi yang melibatkan sel ES dan sel germ primordial, telah digunakan untuk memproduksi host model tikus. Pluripotensial sel ES didapat dari embrio pre-implantasi awal dan dipertahankan pada kultur selama periode tertentu untuk menunjukkan beberapa manipulasi in vitro. Sel mungkin diinjeksi langsung pada blastocoel blastosit host atau diinkubasi bergabung dengan morula. Embrio host kemudian ditransfer pada host intermediate atau betina pengganti untuk kelanjutan perkembangan. Efisiensi produksi tikus chimera menghasilkan 30% keturunan hidup yang mengandung jaringan terderivasi dari sel stem terinjeksi. Kemampuan memproduksi hewan chimeric menggunakan sel ES telah memberikan peneliti alat lain dalam memproduksi hewan transgenik. Pada teknik ini, kekuatan teknologi transfer gen telah mengalami kemajuan karena beberapa proses memungkinkan insersi tertarget pada genom. Penargetan ini sangat penting, terutama pada area terapi dan koreksi gen, sedangkan teknologi terdahulu hanya memungkinkan integrasi acak.
Genom sel ES dapat dimanipulasi in vitro melalui pengenalan gen asing atau sekuen DNA asing melalui teknik elektroporasi, mikroinjeksi, reaksi presipitasi, transfeksi, atau insersi retrovirus. Penggunaan sel ES dalam memproduksi tikus transgenik menghadapi beberapa rintangan sebelum menjadi kompetitif dengan DNA mikroinjeksi sebagai teknik standar model tikus. Dalam beberapa tahun, penambahan teknik coculture melibatkan embrio host tetraploid (tahap 8 sel sampai morula) telah menghasilkan hewan awal yang terderivasi lengkap dari sel ES ter-coculture (Wood dkk., 1993). Oleh karena itu, hewan awal tidak lagi merupakan hewan chimera, karena semua sel datang dari sel progenitor yang sama dan hewan awal akan dapat berkembang biak dengan baik (dan diyakini menghubungkan modifikasi genetik pada keturunan pertama).
Namun, saat keturunan sel ES telah diidentifikasi untuk spesies selain tikus, produksi komponen germ-line ES terderivasi/chimeric dari hewan ternak belum dilaporkan. Dengan adanya teknologi terkait transfer nukleus, kebutuhan mengidentifikasi dan menggunakan sel ES atau sel germinal primordial (PGCs) akan mempengaruhi perubahan genetik dan mungkin semakin tidak konsekuen.
Teknologi lain: dari spermatozoa hingga kloning
Berbeda dengan perkembangan manipulasi embrio, kebijaksanaan yang sangat berbeda telah diambil dengan adanya prosedur transfer sperma. Pada 1989, transfer gen termediasi sperma telah dilaporkan namun dibantah saat banyak laboratorium di seluruh dunia tidak dapat melakukan lagi prosedur tersebut. Kemudian pada 1994, berita sperma termediasi menimbulkan ketertarikan dan menghasilkan perkembangan prosedur transplantasi sel spermatogonia sebagai alternatif potensial bagi transfer gen in vivo (Brinster dan Avarbock, 1994). Namun, semua hewan dan teknik sel somatik (termasuk transfer gen liposome termediasi, pengeboman partikel, dan injeksi jet), bersama dengan sistem vektor novel, akan berlanjut untuk berkembang dengan tujuan untuk merekayasa genetik hewan pada cara yang efisien dan efektif.
Pada awal 1980-an, beberapa laboratorium melaporkan percobaan transfer nukleus pada hewan laboratorium. Beberapa studi ini kontroversial, kebanyakan fokus pada hewan domestik dan vertabrata non-mamalia. Seperti yang akan dijelaskan pada bab selanjutnya, transfer nukleus telah dilakukan dengan fokus percobaan rekayasa genetika.
Produksi Hewan Domestik Transgenik
Kesuksesan percobaan tikus transgenik mengawali sejumlah kelompok penelitian untuk mempelajari transfer gen tersusun yang mirip pada germ-line spesies hewan domestik. Dengan perkecualian, usaha ini mengarah pada dua tujuan utama: meningkatkan produktifitas spesies hewan domestik sebagai bahan pangan atau perkembangan hewan transgenik untuk bioreaktor (produksi kebutuhan medis atau protein penting biologi). Sejak 1985, mayoritas hewan ternak transgenik diciptakan menggunakan gen pertumbuhan tersusun. Namun sayangnya, pada kebanyakan bagian, fenotip pertumbuhan ideal tidak dapat dicapai karena ketidakmampuan untuk mengkoordinasi pengaturan ekspresi gen dan berakibat pada gangguan endokrin.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 3
