Produksi Hewan Laboratorium TransgenikTikus dan hewan laboratorium lain
Kepentingan relatif dalam penggunaan strain atau breed tertentu pada percobaan transfer gen akan sangat menyimpang tergantung pada spesies. Mungkin sistem yang paling kompleks adalah produksi tikus transgenik karena begitu banyak pekerjaan yang dilakukan oleh spesies ini. Perbedaan
yang terdokumentasi dengan baik pada produktifitas reproduksi, perilaku, kebutuhan rumah tangga terkait, dan respon terhadap berbagai prosedur percobaan mempengaruhi efisiensi dan tingkat usaha yang berhubungan dengan produksi hewan transgenik awal. Diskusi umum tentang faktor ini kemudian bertindak sebagai langkah awal untuk memahami banyak proses dan prosedur yang harus dievaluasi dan dimonitor saat mempertimbangkan produksi hewan transgenik.
DNA mikroinjeksi, metode paling terarah dan menghasilkan untuk memproduksi hewan transgenik, memerlukan beberapa “pool” hewan yang dipelihara untuk tujuan tertentu. Peralatan dan perlengkapan diperlukan untuk prosedur ini, seperti prosedur transfer gen lain pada berbagai spesies antara lain adalah mikroinjeksi, mikroskop mikroinjeksi, microforge, dan pipette puller. Paling umum, betina donor diinduksi superovulasi menggunakan injeksi gonadotropin. Betina donor ini kemudian dikawinkan dengan jantan fertil dan sejumlah besar zigot diamati. Alternatif lain, ovum dikoleksi dari betina donor kemudian dipindahkan pada in vitro maturasi (IVM) dan atau in vitro fertilisasi (IVF) untuk mengamati ovum yang hidup. Di lain pihak, DNA terkonstruksi pada larutan buffer dimikroinjeksikan pada pronukleus jantan dalam pronukleus zigot atau pada nukleus ovum tahap akhir. Ovum yang bertahan kemudian ditransfer ke traktus reproduksi betina resipien yang telah disinkronisasi hormon sehingga menjadi pseudopregnant dengan membawa embrio (pseudopregnant diinduksi dengan perkawinan dengan jantan tervasektomi, karena stimulasi servikalis rodensia dibutuhkan untuk pemeliharaan kebuntingan).
Selain tikus, spesies hewan laboratorium lainnya penting untuk mempelajari fenomena biologi tertentu. Kepentingan protokol optimum tidak dapat diremehkan. Pada berbagai spesies, seleksi dan manajemen betina donor yang merespon terhadap sinkronisasi hormonal dan superovulasi, resipien embrio transfer yang dapat membawa fetus dan menjaga neonatus, dan penggunaan efektif pejantan dalam breeding akan menambah efisiensi percobaan. Bagaimanapun juga, metode dalam sinkronisasi hormon, seleksi betina proestrus, dan evaluasi bentuk perilaku reproduksi mungkin berbeda dari yang teridentifikasi pada tikus. Protokol hewan transgenik berkembang pada tikus telah dimodifikasi untuk mengakomodasi produksi spesies transgenik lainnya.
DNA mikroinjeksi
DNA mikroinjeksi meliputi penggunaan mikro-manipulator dan aparatus mikroinjeksi dengan tenaga udara atau minyak yang secara fisik diinjeksikan pada larutan DNA terkonstruksi pada ovum. Secara virtual semua DNA terkloning dapat digunakan. Dengan beberapa pengecualian, gen yang telah dimikroinjeksi menyusun integrasi secara acak melalui genom host, tapi biasanya hanya pada lokasi kromosom single (tempat integrasi). Fakta ini dapat dieksploitasi secara stimultan co-inject lebih dari satu susunan DNA ke zigot, susunan ini kemudian berintegrasi pada single site integration dengan lokasi acak.
Proses integrasi hanya sedikit dimengerti, tapi telah jelas bahwa tidak melibatkan rekombinasi homolog. Selama integrasi, copy transgenes single maupun multiple (biasanya sebanyak beberapa ratus copy sekuen partikular) bergabung menjadi genom DNA, didominasi sebagai jumlah copy pada kepala-ekor concatemer. Elemen pengatur pada DNA host dekat dengan tempat integrasi, dan kemampuan umum area ini untuk transkripsi tampak memainkan peranan penting dalam mempengaruhi level ekspresi transgenes. Efek posisional ini diduga untuk menjelaskan mengapa level ekspresi beberapa transgene mungkin berganti antara hewan awal individu dan keturunan mereka. Karena itu menimbulkan kewaspadaan untuk memeriksa ekspresi transgene pada keturunan dari sekurangnya tiga atau empat hewan awal dengan tujuan untuk menentukan apa yang mungkin dihasilkan dari lokasi integrasi dan apa yang mungkin merefleksikan aktifitas transgene.
DNA host yang dekat dengan tempat integrasi secara frekuen membentuk berbagai bentuk duplikasi sekuen, penghapusan, atau pengaturan ulang sebagai hasil penggabungan transgene. Peningkatan mungkin akan mengganggu fungsi gen host aktif secara normal pada tempat integrasi dan membentuk mutagenesis insertional, dan penyimpangan fenotip dapat terjadi. Beberapa kejadian tidak dapat didesain, tapi telah menghasilkan penemuan gen dan fungsi gen yang tidak diharapkan sebelumnya. Karena DNA mikroinjeksi biasanya dilakukan pada ovum pada tahap satu sel, penggabungan transgene terjadi pada setiap sel dan berkontribusi pada perkembangan embrio. Penggabungan transgene menjadi sel akan berkontribusi pada perkembangan sel germinal (sperma atau ovum) dan biasa terjadi pada metode ini, dan membuat heritabilitas transgene keturunan dari hewan awal mirip pada satu generasi. Pada beberapa kasus, transgene disebut menjadi germ-line atau hewan germ-line competent. Namun, integrasi DNA mikroinjeksi menyusun genom host mungkin akan tertunda. Pada beberapa kasus, jika sel pada embrio awal (blastomere) mengalami mitosis sebelum integrasi transgene terjadi, beberapa namun tidak semua sel akan mengandung transgene, dan hewan awal meskipun tetap transgenik akan terklasifikasi sebagai mosaic atau chimera.
Keuntungan metode DNA mikroinjeksi :
a) Memiliki frekuensi relatif tinggi untuk menciptakan hewan transgenik (20-30% keturunan hidup).
b) Kemungkinan transmisi germ-line transgene tinggi.
c) Relatif kurang membatasi ukuran atau tipe susunan DNA yang digunakan.
d) Transgene relatif stabil saat ditransmisikan dari generasi ke generasi.
e) Frekuensi mosaic atau integrasi ganda rendah (10-30%).
Sedangkan kelemahan metode ini adalah:
a) Pengaruh signifikan potensial dan acak pada tempat integrasi dapat menimbulkan ekspresi transgene (efek potensial).
b) Potensial terhadap mutagenesis insertional yang tidak diharapkan.
c) Kadang menghasilkan mosaic awal.
d) Kadang lemah dalam penggabungan germ-line.
e) Membutuhkan waktu dan uang untuk mengamati mikromanipuasi dan keahlian mikroinjeksi.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 2
DNA mikroinjeksi, metode paling terarah dan menghasilkan untuk memproduksi hewan transgenik, memerlukan beberapa “pool” hewan yang dipelihara untuk tujuan tertentu. Peralatan dan perlengkapan diperlukan untuk prosedur ini, seperti prosedur transfer gen lain pada berbagai spesies antara lain adalah mikroinjeksi, mikroskop mikroinjeksi, microforge, dan pipette puller. Paling umum, betina donor diinduksi superovulasi menggunakan injeksi gonadotropin. Betina donor ini kemudian dikawinkan dengan jantan fertil dan sejumlah besar zigot diamati. Alternatif lain, ovum dikoleksi dari betina donor kemudian dipindahkan pada in vitro maturasi (IVM) dan atau in vitro fertilisasi (IVF) untuk mengamati ovum yang hidup. Di lain pihak, DNA terkonstruksi pada larutan buffer dimikroinjeksikan pada pronukleus jantan dalam pronukleus zigot atau pada nukleus ovum tahap akhir. Ovum yang bertahan kemudian ditransfer ke traktus reproduksi betina resipien yang telah disinkronisasi hormon sehingga menjadi pseudopregnant dengan membawa embrio (pseudopregnant diinduksi dengan perkawinan dengan jantan tervasektomi, karena stimulasi servikalis rodensia dibutuhkan untuk pemeliharaan kebuntingan).
Selain tikus, spesies hewan laboratorium lainnya penting untuk mempelajari fenomena biologi tertentu. Kepentingan protokol optimum tidak dapat diremehkan. Pada berbagai spesies, seleksi dan manajemen betina donor yang merespon terhadap sinkronisasi hormonal dan superovulasi, resipien embrio transfer yang dapat membawa fetus dan menjaga neonatus, dan penggunaan efektif pejantan dalam breeding akan menambah efisiensi percobaan. Bagaimanapun juga, metode dalam sinkronisasi hormon, seleksi betina proestrus, dan evaluasi bentuk perilaku reproduksi mungkin berbeda dari yang teridentifikasi pada tikus. Protokol hewan transgenik berkembang pada tikus telah dimodifikasi untuk mengakomodasi produksi spesies transgenik lainnya.
DNA mikroinjeksi
DNA mikroinjeksi meliputi penggunaan mikro-manipulator dan aparatus mikroinjeksi dengan tenaga udara atau minyak yang secara fisik diinjeksikan pada larutan DNA terkonstruksi pada ovum. Secara virtual semua DNA terkloning dapat digunakan. Dengan beberapa pengecualian, gen yang telah dimikroinjeksi menyusun integrasi secara acak melalui genom host, tapi biasanya hanya pada lokasi kromosom single (tempat integrasi). Fakta ini dapat dieksploitasi secara stimultan co-inject lebih dari satu susunan DNA ke zigot, susunan ini kemudian berintegrasi pada single site integration dengan lokasi acak.
Proses integrasi hanya sedikit dimengerti, tapi telah jelas bahwa tidak melibatkan rekombinasi homolog. Selama integrasi, copy transgenes single maupun multiple (biasanya sebanyak beberapa ratus copy sekuen partikular) bergabung menjadi genom DNA, didominasi sebagai jumlah copy pada kepala-ekor concatemer. Elemen pengatur pada DNA host dekat dengan tempat integrasi, dan kemampuan umum area ini untuk transkripsi tampak memainkan peranan penting dalam mempengaruhi level ekspresi transgenes. Efek posisional ini diduga untuk menjelaskan mengapa level ekspresi beberapa transgene mungkin berganti antara hewan awal individu dan keturunan mereka. Karena itu menimbulkan kewaspadaan untuk memeriksa ekspresi transgene pada keturunan dari sekurangnya tiga atau empat hewan awal dengan tujuan untuk menentukan apa yang mungkin dihasilkan dari lokasi integrasi dan apa yang mungkin merefleksikan aktifitas transgene.
DNA host yang dekat dengan tempat integrasi secara frekuen membentuk berbagai bentuk duplikasi sekuen, penghapusan, atau pengaturan ulang sebagai hasil penggabungan transgene. Peningkatan mungkin akan mengganggu fungsi gen host aktif secara normal pada tempat integrasi dan membentuk mutagenesis insertional, dan penyimpangan fenotip dapat terjadi. Beberapa kejadian tidak dapat didesain, tapi telah menghasilkan penemuan gen dan fungsi gen yang tidak diharapkan sebelumnya. Karena DNA mikroinjeksi biasanya dilakukan pada ovum pada tahap satu sel, penggabungan transgene terjadi pada setiap sel dan berkontribusi pada perkembangan embrio. Penggabungan transgene menjadi sel akan berkontribusi pada perkembangan sel germinal (sperma atau ovum) dan biasa terjadi pada metode ini, dan membuat heritabilitas transgene keturunan dari hewan awal mirip pada satu generasi. Pada beberapa kasus, transgene disebut menjadi germ-line atau hewan germ-line competent. Namun, integrasi DNA mikroinjeksi menyusun genom host mungkin akan tertunda. Pada beberapa kasus, jika sel pada embrio awal (blastomere) mengalami mitosis sebelum integrasi transgene terjadi, beberapa namun tidak semua sel akan mengandung transgene, dan hewan awal meskipun tetap transgenik akan terklasifikasi sebagai mosaic atau chimera.
Keuntungan metode DNA mikroinjeksi :
a) Memiliki frekuensi relatif tinggi untuk menciptakan hewan transgenik (20-30% keturunan hidup).
b) Kemungkinan transmisi germ-line transgene tinggi.
c) Relatif kurang membatasi ukuran atau tipe susunan DNA yang digunakan.
d) Transgene relatif stabil saat ditransmisikan dari generasi ke generasi.
e) Frekuensi mosaic atau integrasi ganda rendah (10-30%).
Sedangkan kelemahan metode ini adalah:
a) Pengaruh signifikan potensial dan acak pada tempat integrasi dapat menimbulkan ekspresi transgene (efek potensial).
b) Potensial terhadap mutagenesis insertional yang tidak diharapkan.
c) Kadang menghasilkan mosaic awal.
d) Kadang lemah dalam penggabungan germ-line.
e) Membutuhkan waktu dan uang untuk mengamati mikromanipuasi dan keahlian mikroinjeksi.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 2
