Analisis Manipulasi Genetik: Transgenes dan Modifikasi Lain
Modifikasi genetika
Wakil jaringan untuk analisis integrasi transgene dan ekspresindapat diamati saat kelahiran. Untuk analisis integrasi, jaringan ekor dan darah dapat diperiksa. Penentuan awal integrasi transgene melalui teknik PCR sangat berguna saat sekuen target (transgene) melewati sekuen unik (tidak endogen dengan genom hewan).
Modifikasi genetika
Wakil jaringan untuk analisis integrasi transgene dan ekspresindapat diamati saat kelahiran. Untuk analisis integrasi, jaringan ekor dan darah dapat diperiksa. Penentuan awal integrasi transgene melalui teknik PCR sangat berguna saat sekuen target (transgene) melewati sekuen unik (tidak endogen dengan genom hewan).
Bagaimana pun juga, pemberian sensitifitas tinggi pada PCR, teknik informasi lain (DNA slot blot atau hibridisasi blot Southern) harus digunakan untuk mengkonfirmasi adanya transgene.
Southern blotting adalah yang paling sering digunakan karena dapat mengindikasi jumlah copy transgene, panjang sekuen target, dan kemungkinan mutasi sekuen (dimana sekuen teridentifikasi tidak tersedia dan sangat utuh). Terlebih lagi, transgene dapat disusun dengan molekuler tag yaitu sekuen unik yang dengan mudah terdeteksi dan memiliki kemiripan minimal dengan sekuen endogen. Strategi ini berguna saat transgene itu sendiri mirip atau hampir identik dengan gen endogen. Pada beberapa kasus, strategi lain yang mungkin membantu adalah pengenalan situs pengikatan baru kepada transgene, tanpa fungsi perturbing, sehingga analisis restriction fragmen lenght polymorphism (RFLP) dapat digunakan untuk membedakan modifikasi gen dari counterpart endogen (salah satu harus eksisi). Akhirnya, pada beberapa instansi screening fenotip memungkinkan studi loss-of-fuction dan gain-of-function, jika modifikasi genetik mengakibatkan perubahan teridentifikasi pada penampakan hewan. Screening fenotip melalui co-transfer transgene kedua atau penanda yang memberi kesempatan untuk menspesifikkan fenotip juga dapat berguna, terutama pada model dimana co-integrates penanda dengan sekuen ineterst dalam DNA mikroinjeksi, atau penanda dapat berhubungan dengan sel tertentu yang digunakan dalam transfer nukleus. Bagaimanapun juga, pada skenario di atas, integrasi modifikasi genetik yang diinginkan harus dikonfirmasi dengan teknik langsung lainnya.
Topik terkait adalah analisis modifikasi genetik bervariasi dari model pengurangan fungsi sampai penambahan fungsi. Pada penambahan fungsi, atau dimana gen supresor digunakan untuk menginduksi pengurangan fungsi, penting untuk mengkarakterisasi jumlah copy transgene per sel, orientasi pasangan copy, adanya multiple tempat integasi, dan kemungkinan status methylation (atau mengidentifikasi kejadian post-transisional lain). Pertanyaan ini dapat dijawab oleh Southern blot hibridisasi yang memungkinkan digesti genom DNA dengan enzim retriksi. Sebaliknya, pada pengurangan fungsi dimana target disrupsi atau “knock-out” terkondisi dapat disebut kejadian kedua (Cre-lox targeting vectors dimana sekuen tertentu dihilangkan dari genom), analisa lokus kromososm termodifikasi menjamin karakterisasi kejadian target spesifik. Yang terakhir, pertanyaan kritis mengenai apakah modifikasi dapat diwarisi dengan stabil juga harus dapat dijawab.
Ekspresi mRNA transgene-encoded
Absennya ekspresi mRNA pada model pengurangan fungsi dan mungkin hanya mewakili tahap konfirmasi pada signifikan minor, analisis ekspresi transgene sangat penting dalam penentuan ketidakpentingan hewan transgenik tertentu. Secara teknik, tahap yang paling kritis dalam analisis ekspresi transgene adalah pada isolasi RNA. Ketelitian sangat diperlukan untuk mencegah kontaminasi pada persiapan RNA dengan ribonukleus (enzim yang mendegradasi RNA). Adanya spesifik RNA biasanya ditentukan oleh RNA slot-blot atau hibridisasi northen blot. Northen blotting lebih informatif dalam konfirmasi tidak hanya keberadaan namun juga ukuran transcript mRNA interest.
Diperlukan teknik tambahan untuk penentuan adanya level atau level relatif mRNA transcript dari hewan transgenik. Pada assay perlindungan nukleus, probe terlabel dimungkinkan terhibridisasi untuk larutan RNA, diikuti dengan digesti nukleus oleh RNA non-hybridized. Sampel kemudian dipisahkan dalam gel polyacrylamide. Teknik ini sangat berguna untuk penentuan level status siaga RNA dalam jaringan. Pada assay reserve-transcription (RT-PCR), RNA interest ditranskrip menjadi molekul cDNA dengan menggunakan primer spesifik dan enzim reverse transcriptase. Primer kedua ditambahkan dan standar amplifikasi PCR dapat diperoleh. Manfaat RT-PCR adalah sangat sensitif yaitu secara teori satu molekul mRNA dapat diamplifikasi menjadi jumlah yang cukup untuk visualisasi pada gel agarose. Terakhir, pada teknik hibridisasi in situ, probe terlabel dihibridisasi pada transcript mRNA target pada bagian jaringan sehingga sel individual yang mengandung transkripsi dapat teridentifikasi. Teknik ini berguna pada identifikasi sel subset kecil pada jaringan yang mungkin terlalu banyak untuk dideteksi dengan cara lain.
Ekspresi protein transgene-encoded
Berbagai teknik digunakan untuk mengidentifikasi protein unik atau aktifitas enzim spesifik. Teknik imunoblotting, dimana protein dipisahkan pada gel polyacrylamide, ditransfer pada membran, dan dideteksi dengan antibodi terlabel, digunakan pada penentuan berat molekul pada produk protein interest. Untuk mengidentifikasi sel jaringan mana yang mengandung produk protein transgene, pengecatan imunohistikimia bagian jaringan dengan antibodi terlabel juga dapat digunakan. Sebagai tambahan, penggunaan gen reporter (onkogen, hormon pertumbuhan, atau gen protein flourescent) dapat dengan sederhana menentukan level ekspresi dengan memproduksi protein yang dengan mudah terdeteksi.
Pada analisis ekspresi transgene, penting untuk mengevaluasi sekurangnya 2 keturunan hewan transgenik dengan tujuan untuk menunjukkan pola ekspresi yang konsisten dan reproduktif. Umumnya tempat integrasi dalam keturunan hewan transgenik mempengaruhi ekspresi transgene, tidak tergantung pada kontrol transcript sekuen pada transgene itu sendiri.
Kesimpulan dan Arah ke Depan
Transfer gen dan rekayasa genetik pada masa kini
Keahlian dan usaha yang terlibat dalam percobaan transfer gen pada biologi hewan cukup signifikan dan menantang. Teknologi inovatif untuk meningkatkan efisiensi percobaan transfer gen pada spesies yang berbeda sangat diperlukan. Seperti teknik yang mampu tidak hanya membawa biaya proyek individual menjadi alasan hambatan namun juga mampu meningkatkan inovasi baru pada berbagai bidang. Efisiensi tersebut untuk produksi hewan transgenik mewakili apa yang dipertimbangkan teknologi terkini. Hal ini terlihat bahwa prosedur akan termodifikasi dan ditingkatkan sebagai penelitian baru. Seperti beberapa pencapaian spesifik yang meningkatkan efisiensi produktifitas. Teknologi yang tersedia akan terpusat pada area:
a) Perkembangan sistem pengiriman DNA alternatif (transfer gen liposom termediasi, teknik sel somatik tertarget).
b) Identifikasi kondisi optimal untuk prosedur transfer gen dan identifikasi breed terbaik yang cocok untuk teknologi spesifik.
c) Pemetaan genom hewan secara lengkap dan identifikasi gen manusia yang homolog.
d) Pembentukan kultur germplasma yang rutin dan efisien dan sistem preservasi (dari preservasi jaringan gonad untuk kultur dan gamet cryostorage).
e) Perkembangan nilai untuk menurunkan jumlah hewan dan embrio yang dibutuhkan (penggunaan amplifikasi PCR untuk blastomere DNA, atau analisis penyortir sel flourescent teraktifasi [FACS] dan memasukkan germplasma yang termodifikasi genetik).
Pertimbangan utama untuk manipulasi genetik dan transfer gen tidak terbatas pada manajemen hewan (termasuk manipulasi bedah dan handling embrio), tapi juga keahlian dalam kultur jaringan dan sel serta teknik biologi molekul. Untuk kebanyakan spesies, pertimbangan pemeliharaan yang ekstensif dan kebutuhan catatan manajemen betina spesifik (siklus estrus terkontrol/sinkronisasi) dan jantan spesifik (analisis sperma/kuantitas). Panen embrio dan trauma terkait manipulasi adalah faktor yang signifikan. Kesempurnaan teknik nonsurgical untuk koleksi embrio dan transfer embrio akan membutuhkan biaya dan kebutuhan tenaga kerja yang besar untuk menjaga kelangsungan program hewan transgenik. Lebih penting lagi, percobaan hewan yang lebih banyak akan menuju ke manipulasi bedah yang signifikan. Terakhir, desain percobaan yang baik adalah pertimbangan etika dan kebutuhan regulasi terkait dengan percobaan rekayasa genetika.
Arah ke depan
Manfaat transfer nukleus memungkinkan alternatif untuk perkembangan teknologi sel ES pluripotensial yaitu usaha yang telah menjadi “Holy Grail” oleh para ahli genetika hewan dan ahli bioteknologi. Namun, kekompleksan genom hewan, penentuan gen untuk direkayasa dan ditransfer akan sangat penting. Apa target genetik yang paling baik pada spesies yang berbeda dan bagaimana manipulasi penargetan gen akan mempengaruhi perkembangan mamalia? Jika genetik polimorphism (indikasi gen terkait yang mengkode protein isoform berbeda) atau adanya pseudogen, usaha penargetan akan panjang dan sulit. Untuk genom yang terkarakterisasi baik, identifikasi variasi genetik spesifik hanya akan memungkinkan sedikit usaha penting untuk mengembangkan pada spesies lain. Namun, diharapkan dengan usaha terkini yang fokus pada sejumlah genom mamalia, akumulasi data akan memberikan informasi yang cukup dan dapat diadaptasikan pada spesies lain, seperti kelompok terkait yang memiliki kemungkinan dan dapat tereksploitasi dengan baik.
Telah banyak dipelajari tentang berbagai proses fisiologi pada hewan transgenik yang diciptakan akhir-akhir ini. Meskipun jika produksi hewan yang lebih baik tidak dapat dicapai namun studi terdahulu bukanlah tidak sukses. Berbagai hewan transgenik telah mencapai regulasi dan proses perkembangan yang sebelumnya tidak dimengerti pada spesies agrikultural. Saat studi ekspresi transgene pada hewan ternak tidak selalu berhubungan, manfaat model hewan transgenik dalam penemuan ilmu pengetahuan tidak dapat diremehkan. Penggunaan prosedur transfer nukleus atau metodologi terkait yang memungkinkan manipulasi in vivo yang efisien dan tertarget menawarkan prospek penciptaan model hewan yang berdaya guna untuk aplikasi agrikultur dan biomedis. Bagaimanapun juga, jalan kesuksesan akan terus berlanjut menjadi sulit namun menantang untuk ilmuwan pada abad ke-21.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 6/akhir
Southern blotting adalah yang paling sering digunakan karena dapat mengindikasi jumlah copy transgene, panjang sekuen target, dan kemungkinan mutasi sekuen (dimana sekuen teridentifikasi tidak tersedia dan sangat utuh). Terlebih lagi, transgene dapat disusun dengan molekuler tag yaitu sekuen unik yang dengan mudah terdeteksi dan memiliki kemiripan minimal dengan sekuen endogen. Strategi ini berguna saat transgene itu sendiri mirip atau hampir identik dengan gen endogen. Pada beberapa kasus, strategi lain yang mungkin membantu adalah pengenalan situs pengikatan baru kepada transgene, tanpa fungsi perturbing, sehingga analisis restriction fragmen lenght polymorphism (RFLP) dapat digunakan untuk membedakan modifikasi gen dari counterpart endogen (salah satu harus eksisi). Akhirnya, pada beberapa instansi screening fenotip memungkinkan studi loss-of-fuction dan gain-of-function, jika modifikasi genetik mengakibatkan perubahan teridentifikasi pada penampakan hewan. Screening fenotip melalui co-transfer transgene kedua atau penanda yang memberi kesempatan untuk menspesifikkan fenotip juga dapat berguna, terutama pada model dimana co-integrates penanda dengan sekuen ineterst dalam DNA mikroinjeksi, atau penanda dapat berhubungan dengan sel tertentu yang digunakan dalam transfer nukleus. Bagaimanapun juga, pada skenario di atas, integrasi modifikasi genetik yang diinginkan harus dikonfirmasi dengan teknik langsung lainnya.
Topik terkait adalah analisis modifikasi genetik bervariasi dari model pengurangan fungsi sampai penambahan fungsi. Pada penambahan fungsi, atau dimana gen supresor digunakan untuk menginduksi pengurangan fungsi, penting untuk mengkarakterisasi jumlah copy transgene per sel, orientasi pasangan copy, adanya multiple tempat integasi, dan kemungkinan status methylation (atau mengidentifikasi kejadian post-transisional lain). Pertanyaan ini dapat dijawab oleh Southern blot hibridisasi yang memungkinkan digesti genom DNA dengan enzim retriksi. Sebaliknya, pada pengurangan fungsi dimana target disrupsi atau “knock-out” terkondisi dapat disebut kejadian kedua (Cre-lox targeting vectors dimana sekuen tertentu dihilangkan dari genom), analisa lokus kromososm termodifikasi menjamin karakterisasi kejadian target spesifik. Yang terakhir, pertanyaan kritis mengenai apakah modifikasi dapat diwarisi dengan stabil juga harus dapat dijawab.
Ekspresi mRNA transgene-encoded
Absennya ekspresi mRNA pada model pengurangan fungsi dan mungkin hanya mewakili tahap konfirmasi pada signifikan minor, analisis ekspresi transgene sangat penting dalam penentuan ketidakpentingan hewan transgenik tertentu. Secara teknik, tahap yang paling kritis dalam analisis ekspresi transgene adalah pada isolasi RNA. Ketelitian sangat diperlukan untuk mencegah kontaminasi pada persiapan RNA dengan ribonukleus (enzim yang mendegradasi RNA). Adanya spesifik RNA biasanya ditentukan oleh RNA slot-blot atau hibridisasi northen blot. Northen blotting lebih informatif dalam konfirmasi tidak hanya keberadaan namun juga ukuran transcript mRNA interest.
Diperlukan teknik tambahan untuk penentuan adanya level atau level relatif mRNA transcript dari hewan transgenik. Pada assay perlindungan nukleus, probe terlabel dimungkinkan terhibridisasi untuk larutan RNA, diikuti dengan digesti nukleus oleh RNA non-hybridized. Sampel kemudian dipisahkan dalam gel polyacrylamide. Teknik ini sangat berguna untuk penentuan level status siaga RNA dalam jaringan. Pada assay reserve-transcription (RT-PCR), RNA interest ditranskrip menjadi molekul cDNA dengan menggunakan primer spesifik dan enzim reverse transcriptase. Primer kedua ditambahkan dan standar amplifikasi PCR dapat diperoleh. Manfaat RT-PCR adalah sangat sensitif yaitu secara teori satu molekul mRNA dapat diamplifikasi menjadi jumlah yang cukup untuk visualisasi pada gel agarose. Terakhir, pada teknik hibridisasi in situ, probe terlabel dihibridisasi pada transcript mRNA target pada bagian jaringan sehingga sel individual yang mengandung transkripsi dapat teridentifikasi. Teknik ini berguna pada identifikasi sel subset kecil pada jaringan yang mungkin terlalu banyak untuk dideteksi dengan cara lain.
Ekspresi protein transgene-encoded
Berbagai teknik digunakan untuk mengidentifikasi protein unik atau aktifitas enzim spesifik. Teknik imunoblotting, dimana protein dipisahkan pada gel polyacrylamide, ditransfer pada membran, dan dideteksi dengan antibodi terlabel, digunakan pada penentuan berat molekul pada produk protein interest. Untuk mengidentifikasi sel jaringan mana yang mengandung produk protein transgene, pengecatan imunohistikimia bagian jaringan dengan antibodi terlabel juga dapat digunakan. Sebagai tambahan, penggunaan gen reporter (onkogen, hormon pertumbuhan, atau gen protein flourescent) dapat dengan sederhana menentukan level ekspresi dengan memproduksi protein yang dengan mudah terdeteksi.
Pada analisis ekspresi transgene, penting untuk mengevaluasi sekurangnya 2 keturunan hewan transgenik dengan tujuan untuk menunjukkan pola ekspresi yang konsisten dan reproduktif. Umumnya tempat integrasi dalam keturunan hewan transgenik mempengaruhi ekspresi transgene, tidak tergantung pada kontrol transcript sekuen pada transgene itu sendiri.
Kesimpulan dan Arah ke Depan
Transfer gen dan rekayasa genetik pada masa kini
Keahlian dan usaha yang terlibat dalam percobaan transfer gen pada biologi hewan cukup signifikan dan menantang. Teknologi inovatif untuk meningkatkan efisiensi percobaan transfer gen pada spesies yang berbeda sangat diperlukan. Seperti teknik yang mampu tidak hanya membawa biaya proyek individual menjadi alasan hambatan namun juga mampu meningkatkan inovasi baru pada berbagai bidang. Efisiensi tersebut untuk produksi hewan transgenik mewakili apa yang dipertimbangkan teknologi terkini. Hal ini terlihat bahwa prosedur akan termodifikasi dan ditingkatkan sebagai penelitian baru. Seperti beberapa pencapaian spesifik yang meningkatkan efisiensi produktifitas. Teknologi yang tersedia akan terpusat pada area:
a) Perkembangan sistem pengiriman DNA alternatif (transfer gen liposom termediasi, teknik sel somatik tertarget).
b) Identifikasi kondisi optimal untuk prosedur transfer gen dan identifikasi breed terbaik yang cocok untuk teknologi spesifik.
c) Pemetaan genom hewan secara lengkap dan identifikasi gen manusia yang homolog.
d) Pembentukan kultur germplasma yang rutin dan efisien dan sistem preservasi (dari preservasi jaringan gonad untuk kultur dan gamet cryostorage).
e) Perkembangan nilai untuk menurunkan jumlah hewan dan embrio yang dibutuhkan (penggunaan amplifikasi PCR untuk blastomere DNA, atau analisis penyortir sel flourescent teraktifasi [FACS] dan memasukkan germplasma yang termodifikasi genetik).
Pertimbangan utama untuk manipulasi genetik dan transfer gen tidak terbatas pada manajemen hewan (termasuk manipulasi bedah dan handling embrio), tapi juga keahlian dalam kultur jaringan dan sel serta teknik biologi molekul. Untuk kebanyakan spesies, pertimbangan pemeliharaan yang ekstensif dan kebutuhan catatan manajemen betina spesifik (siklus estrus terkontrol/sinkronisasi) dan jantan spesifik (analisis sperma/kuantitas). Panen embrio dan trauma terkait manipulasi adalah faktor yang signifikan. Kesempurnaan teknik nonsurgical untuk koleksi embrio dan transfer embrio akan membutuhkan biaya dan kebutuhan tenaga kerja yang besar untuk menjaga kelangsungan program hewan transgenik. Lebih penting lagi, percobaan hewan yang lebih banyak akan menuju ke manipulasi bedah yang signifikan. Terakhir, desain percobaan yang baik adalah pertimbangan etika dan kebutuhan regulasi terkait dengan percobaan rekayasa genetika.
Arah ke depan
Manfaat transfer nukleus memungkinkan alternatif untuk perkembangan teknologi sel ES pluripotensial yaitu usaha yang telah menjadi “Holy Grail” oleh para ahli genetika hewan dan ahli bioteknologi. Namun, kekompleksan genom hewan, penentuan gen untuk direkayasa dan ditransfer akan sangat penting. Apa target genetik yang paling baik pada spesies yang berbeda dan bagaimana manipulasi penargetan gen akan mempengaruhi perkembangan mamalia? Jika genetik polimorphism (indikasi gen terkait yang mengkode protein isoform berbeda) atau adanya pseudogen, usaha penargetan akan panjang dan sulit. Untuk genom yang terkarakterisasi baik, identifikasi variasi genetik spesifik hanya akan memungkinkan sedikit usaha penting untuk mengembangkan pada spesies lain. Namun, diharapkan dengan usaha terkini yang fokus pada sejumlah genom mamalia, akumulasi data akan memberikan informasi yang cukup dan dapat diadaptasikan pada spesies lain, seperti kelompok terkait yang memiliki kemungkinan dan dapat tereksploitasi dengan baik.
Telah banyak dipelajari tentang berbagai proses fisiologi pada hewan transgenik yang diciptakan akhir-akhir ini. Meskipun jika produksi hewan yang lebih baik tidak dapat dicapai namun studi terdahulu bukanlah tidak sukses. Berbagai hewan transgenik telah mencapai regulasi dan proses perkembangan yang sebelumnya tidak dimengerti pada spesies agrikultural. Saat studi ekspresi transgene pada hewan ternak tidak selalu berhubungan, manfaat model hewan transgenik dalam penemuan ilmu pengetahuan tidak dapat diremehkan. Penggunaan prosedur transfer nukleus atau metodologi terkait yang memungkinkan manipulasi in vivo yang efisien dan tertarget menawarkan prospek penciptaan model hewan yang berdaya guna untuk aplikasi agrikultur dan biomedis. Bagaimanapun juga, jalan kesuksesan akan terus berlanjut menjadi sulit namun menantang untuk ilmuwan pada abad ke-21.
REKAYASA GENETIKA HEWAN*Oleh C. A. Pinket= sebuah terjemahan bebas bagian 6/akhir
